FISH(熒光原位雜交)
熒光原位雜交用于通過(guò)互補(bǔ)探針序列的雜交來(lái)顯示確定的核酸序列。FISH 有很多應(yīng)用,從基本的基因定位到染色體畸變的診斷(細(xì)胞遺傳學(xué))。多色 FISH 圖像分析需要使用單獨(dú)的濾光片激發(fā)塊(立方體)或激發(fā)濾光片轉(zhuǎn)輪結(jié)合多波段二向色鏡和發(fā)射濾光片來(lái)隔離各種信號(hào)。
熒光免疫原位雜交(FISH)和 多路復(fù)用(Densely Multiplexed)成像的串色
當(dāng)同時(shí)使用具有多個(gè)密集光譜的熒光染料時(shí),區(qū)分熒光標(biāo)記的能力決定了檢測(cè)結(jié)果的速度和準(zhǔn)確性。在進(jìn)行熒光免疫原位雜交 (FISH)測(cè)量時(shí),這種密集的圖像復(fù)用特別重要。因此,減少串色(即來(lái)自不希望的熒光染料的信號(hào)相對(duì)于所需熒光染料的信號(hào)影 響)至關(guān)重要。下表量化了使用特定的
BrightLine 熒光免疫原位雜交(FISH)濾光片組時(shí),相鄰熒光染料之間的串?dāng)_值。該串?dāng)_值 決定于典型的歸一化熒光染料光譜、濾光片的設(shè)計(jì)光譜和強(qiáng)金屬鹵化物燈光譜的重疊。
這些結(jié)果已經(jīng)針對(duì)每個(gè)給定的濾光片組進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化,因此用戶(hù)應(yīng)該讀取每行(而不是每列)的值以查看給定濾光片組的預(yù)期串?dāng)_值。
例如,當(dāng)使用 SpectrumGold™ 濾光片組對(duì)標(biāo)記有 SpectrumGreen™、SpectrumGold™ 和 SpectrumRed™ 熒光染料的樣品進(jìn)行 成像時(shí),不需要的 SpectrumGreen 信號(hào)將小于所需要的 SpectrumGold 信號(hào)的 2%,并且 SpectrumRed 信號(hào)將小于1%。
好的濾光片會(huì)帶來(lái)哪些不同 ?
BrightLine“不易燒熔"濾光片在多年的使用中,在研究和臨床領(lǐng)域都得到了廣泛的測(cè)試。BrightLine 熒光免疫原位雜交 FISH 濾光片組也進(jìn)行了嚴(yán)格的獨(dú)立測(cè)試。結(jié)果顯示:使用 BrightLine 濾光片組進(jìn)行熒光免疫原位雜交 FISH 分析時(shí),無(wú)論您是查找 和分析中期分裂,還是通過(guò)點(diǎn)計(jì)數(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分,都可以提高分析的速度和準(zhǔn)確性。
一個(gè)分子吸收其吸收譜帶波長(zhǎng)范圍(即吸收光譜)內(nèi)的光,然后幾乎瞬間發(fā)出較長(zhǎng)的、位于其發(fā)射譜帶波長(zhǎng)范圍(即發(fā)射光譜)內(nèi)的光,此時(shí),就會(huì)發(fā)生光學(xué)熒光。為了達(dá)到分析的目的,強(qiáng)的熒光分子,亦被稱(chēng)為熒光團(tuán)、熒光染料,專(zhuān)門(mén)用于連接到生物分子或其他感興趣的目標(biāo),用于鑒定、定量、甚至實(shí)時(shí)觀察物質(zhì)的生物和化學(xué)活性。熒光染料因?yàn)榫哂?的靈敏度、高特異性和簡(jiǎn)單性,被廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)和分析檢測(cè)中。大多數(shù)熒光儀器,包括熒光顯微鏡,都是基于光學(xué)濾光片。
一個(gè)典型的系統(tǒng)有三個(gè)基本的濾光片組成:激發(fā)濾光片(或吸收濾光片),二向色鏡分束鏡(或二向分色鏡)和發(fā)射濾光片(或阻擋濾光片)。激發(fā)濾光片通常是一個(gè)帶通濾光片,它只透過(guò)熒光染料的吸收波長(zhǎng),從而最大限度地減少熒光的其他來(lái)源的激發(fā)光和阻擋熒光發(fā)射帶內(nèi)的激發(fā)光。二向色鏡分束鏡是一種邊緣濾光片,用于斜角入射 (通常是 45 °),以有效地反射激發(fā)波段的光和透射發(fā)射波段的光。Semrock 發(fā)射濾光片通常是一個(gè)帶通濾光片,僅透過(guò)熒光染料的發(fā)射波長(zhǎng),并阻擋這個(gè)波段之外的所有不需要的光 - 尤其是激發(fā)光。通過(guò)濾光片阻擋不需要的激發(fā)能量(包括紫外和紅外)或樣品和系統(tǒng)的自發(fā)熒光,就可以得到具有黑暗背景的熒光圖像。
我們可以通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)濾光片,組成一個(gè)濾光片組,用于觀察熒光或者對(duì)熒光進(jìn)行成像,這樣就可以達(dá)到使一個(gè)給定的熒光染料可視化的目的。因?yàn)椴煌瑹晒馊玖系募ぐl(fā)光譜和發(fā)射光譜不同,濾光片組需要優(yōu)化,才可以用于不同熒光染料的同時(shí)成像。在不同的實(shí)驗(yàn)條件下使用同一個(gè)熒光染料時(shí),濾光片組也需要優(yōu)化。
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