多光子顯微鏡
在多光子顯微鏡(也稱為非線性或雙光子顯微鏡)中,以兩倍正常激發(fā)波長照射樣品。更長的波長是有利的,因為它們可以更深地穿透樣品進(jìn)行 3D 成像,并且因為它們不會損壞樣品,從而延長樣品壽命。為了實現(xiàn)多光子激發(fā),照明光束在空間上聚焦(使用光學(xué)器件),同時使用高能短脈沖激發(fā)光束以提高兩個(或更多)光子同時到達(dá)同一位置(即熒光團(tuán)分子)的概率。
多光子顯微技術(shù)的例子包括二次諧波產(chǎn)生 (SHG)、三次諧波產(chǎn)生 (THG)、相干反斯托克斯拉曼光譜 (CARS) 和受激發(fā)射耗盡 (STED) 顯微技術(shù)。由于這些技術(shù)中的每一種都使用脈沖激光器,因此選擇能夠最大限度地減少脈沖色散的光學(xué)組件很重要,并且激光反射二向色鏡應(yīng)具有低 GDD 特性。
如圖 2 所示,典型的系統(tǒng)由激發(fā)激光器、掃描和成像光學(xué)器件、靈敏檢測器(通常是光電倍增管)和用于將熒光與激光器分離并阻擋激光的濾光片(二向色分光鏡)組成從到達(dá)檢測器(發(fā)射濾光片)。
多光子成像系統(tǒng)提供的優(yōu)勢包括真正的三維成像、對活組織內(nèi)部深處進(jìn)行成像的能力以及消除平面外熒光。
使用這種方法,可以對斯托克斯位移非常短和/或效率非常低的熒光染料進(jìn)行成像,甚至可以對樣品或組織中固有的熒光分子進(jìn)行成像。多光子成像的缺點包括需要高峰值功率脈沖激光器,例如鎖模鈦:藍(lán)寶石激光器,并且直到現(xiàn)在,缺乏在整個發(fā)射范圍內(nèi)提供足夠吞吐量的高性能濾光片。整個激光調(diào)諧范圍內(nèi)的興趣和足夠的阻擋(圖 3)。
圖 1:來自暴露的小鼠皮層的雙色體內(nèi)雙光子成像。NADH 熒光(紅色)和硫羅丹明標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞(綠色)使用 BrightLine FF01-680/SP 發(fā)射器和 FF665-Di01 二向色鏡拍攝。圖片由羅徹斯特大學(xué)醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)外科系 Karl A. Kasischke 和 Nikhil Mutyal 提供。
圖 2:多光子熒光顯微鏡的典型配置。
圖 3:多光子顯微鏡需要在非常寬的光譜范圍內(nèi)控制光:從近紫外一直到近紅外。
針對多光子顯微鏡優(yōu)化的 Semrock 濾光片Semrock 通過引入具有超高透射率、非常陡峭的邊緣和精心優(yōu)化的阻擋的濾光片,為多光子用戶帶來了增強(qiáng)的性能。考慮到激發(fā)激光器和多光子成像系統(tǒng)的其他復(fù)雜元件通常需要多少投資,這些新的光學(xué)濾光片代表了一種簡單且廉價的升級,可以顯著提高系統(tǒng)性能。
BrightLine®
發(fā)射濾光片提供從近紫外到近紅外的清晰透射(圖 4)。事實上,與傳統(tǒng)濾光片的褐色色調(diào)相比,發(fā)射濾光片看起來像窗戶玻璃一樣清晰,而且 LWP 二向色鏡具有如此寬的反射帶,它們看起來像高反射鏡(圖 5)。發(fā)射濾光片還在 Ti:Sapphire 激光調(diào)諧范圍內(nèi)提供深度阻擋,這對于實現(xiàn)高信噪比和測量靈敏度至關(guān)重要。
有時需要限制在任何給定時間檢測到的熒光發(fā)射光譜帶,特別是當(dāng)使用多個熒光團(tuán)標(biāo)記樣品中的不同目標(biāo)時。較窄的帶通濾光片非常適合此目的,Semrock 提供了多種此類帶通濾光片,可與多光子發(fā)射濾光片結(jié)合使用,幾乎不會丟失熒光信號。
由于非線性光學(xué)效應(yīng)強(qiáng)烈依賴于激光脈沖的峰值強(qiáng)度,因此當(dāng)脈沖展寬(以及隨之而來的峰值強(qiáng)度降低)保持在最/低限度時,會產(chǎn)生*的成像。BrightLine FF670-SDi01 和 FF720-SDi01 短波通二向色分束鏡旨在將激發(fā)激光反射到樣品,同時提供返回的近紫外和可見熒光或 SHG 信號的出色傳輸。與從這些分束鏡反射的激光相關(guān)的群延遲色散 (GDD) 非常低。例如,對于 FF670-SDi01 濾光片,100 fs 變換限制高斯脈沖在整個激光波長范圍內(nèi)的加寬小于 2%,而對于 FF720-SDi01 濾光片在整個激光波長范圍內(nèi)的加寬遠(yuǎn)小于 1%。
圖 4:BrightLine 多光子濾光片提供近乎理想的性能,如“近紫外和可見光"發(fā)射濾光片 FF01-680/SP 和二向色鏡 FF665-Di01 的這些典型測量光譜所示。
圖5:圖 5: BrightLine 多光子濾光片非常清晰!
圖6:使用Semrock多光子濾光片研究表明熒光Ca 2+指示劑蛋白(FCIPs),用于在使用雙光子顯微鏡活細(xì)胞研究的Ca2 +動態(tài)的功率。表達(dá)熒光蛋白 CerTN-L15 的 2/3 層神經(jīng)元的三維重建。
中間:3 張選定的圖像(每張在左側(cè)和右側(cè)分別用數(shù)字標(biāo)記的深度拍攝)。圖片由慕尼黑工業(yè)大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所的 Olga Garaschuk 教授教授提供。(修改自 Heim 等人,Nat. Methods,4(2):127-9,2007 年 2 月。)(Modified from Heim et al., Nat. Methods, 4(2): 127-9, Feb. 2007.)
光學(xué)密度(Optical Density或稱為 OD)是描述光通過高度阻擋的光學(xué)濾光片(當(dāng)光的傳輸非常小時)的透過率的一種方便工 具。OD簡單地定義為對數(shù)(底為10)的負(fù)變量。變量在0和1之間變化(OD = – log10(T))。因此,透過率就簡單等于10的負(fù)OD值的 方 (T = 10– OD), 左圖顯示了OD的影響:6個數(shù)量級(1000000次)的透過率變化,非常簡單地用介于0到6的數(shù)字來表示;下面中間 的示例表和右下的“法則"列表提供了一些方便的技巧,可以在 OD 和透過率之間快速轉(zhuǎn)換。將變量 T 乘以2(或除以10)等于減 去0.3(或加上1),就轉(zhuǎn)換成了 OD 。
光密度本底噪聲:
通過精心優(yōu)化我們的測量設(shè)備和方法,Semrock能夠提供一些優(yōu)化的寬帶光密度(OD)。以下是此網(wǎng)站上顯示的大多數(shù)測量數(shù)據(jù)的典型OD噪聲本底限制。
對于介于320和1120 nm之間的波長,接近或低于3e-7(光學(xué)密度6.5)的透射值受到測量噪聲的限制。
對于波長<320 nm且在1120-1500 nm之間的波長,接近或低于3e-6(光學(xué)密度5.5)的透射值受到測量噪聲的限制。
對于大于1500 nm的波長,接近或低于1e-5(光學(xué)密度5.0)的透射值受到測量噪聲的限制。
同樣,對于某些濾光片和/或某些阻擋波長范圍,顯示的本底噪聲僅為OD 4。
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